RNA pull down
RNA pull down 實(shí)驗(yàn)
RNA pull-down 是檢測(cè) RNA 結(jié)合蛋白與其靶 RNA 之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。RNA pull-
down 使用體外合成或者體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素 RNA 探針，然后與細(xì)胞裂解后的蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過 Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的 RNA 結(jié)合蛋白是否與 RNA 相互作用。因此，RNA pull down 常被用來研究 LncRNA 相互作用的蛋白。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.準(zhǔn)備細(xì)胞裂解物
a.收取目的細(xì)胞（~107），1000 rpm，4℃離心 5min 收獲細(xì)胞，棄去上清。
b.使用加入 1ml 冰冷的 PBS 重懸細(xì)胞，1000 rpm，4℃離心 5min。
c.加入 500 ul Cell lysis buffer （+新鮮的蛋白酶抑制劑，RNAse 抑制劑，DTT）重懸沉淀，置于冰上 5min，期間顛倒混勻幾次。
d.13000g，4℃離心 10min。
e.收集上清直接用于實(shí)驗(yàn)或儲(chǔ)存于-80 ℃。
2.制備生物素標(biāo)記的 RNA
（1）制備 DNA 模板
（2）體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)
（3）標(biāo)記 RNA 探針
3.RNA 進(jìn)行 Pull down 實(shí)驗(yàn)
a.取 150 µl Pierce Nucleic-Acid Compatible Streptavidin Magnetic Beads，使用 Wash Buffer 洗滌 beads 兩 次，去除 stock solution，最后使用 RNA Capture Buffer 重懸 Beads。
b.在 Beads 中加入已經(jīng)標(biāo)記好的 Biotin-RNA，孵育 15-30 分鐘。
c.使用 Wash Buffer 洗滌 beads 兩次，使用 1xProtein-RNA Binding Buffer 重懸 Beads。
d.進(jìn)行 Pull-down 實(shí)驗(yàn)。體系如下：
| 10X Protein-RNA Binding Buffer | 10 µL |
| 50% glycerol | 30 µL |
| Additional salts, etc. | 10 µL |
| Lysate (protein conc. > 2mg/mL) | 30 µg |
| Nuclease-free water to 100µL | |
e.在 rotary shaker 中 4 ℃翻轉(zhuǎn)孵育 1 h。
g.使用 50 µL Biotin Elution buffer 洗脫蛋白，進(jìn)行下游分析。
4.蛋白鑒定：對(duì)Pull down產(chǎn)物進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)或者做蛋白質(zhì)譜鑒定
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
銀染圖
質(zhì)譜鑒定
WB檢測(cè)
此外，RNA pull down技術(shù)也應(yīng)用在RNA-RNA之間的互作研究中，例如miRNA與lncRNA的結(jié)合，這時(shí)pull down的產(chǎn)物的RNA，對(duì)產(chǎn)物的鑒定需要做PCR，結(jié)果如下圖：
