luciferase
雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase assay）是研究基因之間調(diào)控機(jī)制的方法之一，其闡述的是DNA-DNA,RNA-DNA的調(diào)控關(guān)系。常見(jiàn)的研究有轉(zhuǎn)錄因子TF與靶基因的調(diào)控、miRNA與靶基因的調(diào)控，miRNA與lncRNA/circRNA的調(diào)控。
這里以miRNA與靶基因的調(diào)控研究為例，描述luciferase的研究過(guò)程。
一、生物信息學(xué)分析
通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miRNA與靶基因3'UTR區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)序列。
二、載體構(gòu)建
分別構(gòu)建以下過(guò)表達(dá)質(zhì)粒：
1. miRNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、miRNA-NC
2. 靶基因3'UTR野生型質(zhì)粒WT（LUC載體）
3. 靶基因3'UTR突變型質(zhì)粒MUT（LUC載體）
三、Luciferase檢測(cè)
1. 細(xì)胞培養(yǎng)：
以RPMI1640培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)293T細(xì)胞，至指數(shù)生長(zhǎng)期，1200rpm離心4min.
2. 細(xì)胞鋪板：
以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)收集的293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為105/ML,然后接種至24孔板，每孔的細(xì)胞數(shù)量4×104.
3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：
根據(jù)lipo3000的操作說(shuō)明進(jìn)行共轉(zhuǎn)，共轉(zhuǎn)染分組如下：
A:miRNA + 靶基因3'UTR-WT
B:miRNA + 靶基因3'UTR-MUT
C:miRNA-NC + 靶基因3'UTR-WT
D:miRNA-NC + 靶基因3'UTR-MUT
每組同時(shí)轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶質(zhì)粒pRL-TK作為內(nèi)參。
4. 雙熒光素酶活性檢測(cè)：
4.1 細(xì)胞裂解：
細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，棄上清，并以PBS輕輕洗滌一次細(xì)胞，然后每孔加入200ul細(xì)胞裂解液，冰育5-10min,充分裂解細(xì)胞；
4.2 工作液配制：
按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別以對(duì)應(yīng)的緩沖液稀釋螢火蟲(chóng)熒光素酶底物、海腎熒光素酶底物至1×，冰上靜置；
4.3 熒光檢測(cè)：
取4.1中裂解液20ul,加入96孔酶標(biāo)板中，加入100ul螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)液，放入酶標(biāo)儀，設(shè)置震板混勻，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性；
檢測(cè)完螢火蟲(chóng)熒光素酶活性后，每孔加入100ul海腎熒光素酶反應(yīng)液，放入酶標(biāo)儀，設(shè)置震板混勻，檢測(cè)海腎熒光素酶活性。
5. 數(shù)據(jù)分析、作圖。
